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1、儀器與試劑

　　HP1100型高效液相色譜儀，G1315A DAD 二極管陣列檢測器，G1313A ALS自動進(jìn)樣器;SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm色譜柱。固相萃取小柱為ZORBAX SPE C18Cart。12頭固相萃取真空富集裝置(Alltech Scientific Limited)。超聲波清洗器KS—500D，超速離心機(jī)Gl-25M，攪肉機(jī)，渦旋混合器。甲醇(色譜純)，磷酸二氫鈉(分析純)，EDTA(分析純)，高氯酸溶液(優(yōu)級純)、硝酸(優(yōu)級純)。土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA公司)。

　　2、高效液相色譜分析條件

　　色譜柱為SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm，流動相為0.O1mol/L磷酸二氫鈉+0.001 mol/L EDTA:甲醇=60:40(V/V，pH=2.0)，流速為0.8ml/min，檢測波長為268nm柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μl。

　　3、實(shí)驗(yàn)方法

　　(1)土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

　　分別稱取O.0100mg土霉素、四環(huán)素、金霉素、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品置于4個(gè)1Oml容量瓶中，分別加入甲醇溶解并定容至刻度，此溶液濃度分別為1.00mg/ml，置于冰箱冷藏室保存。

　　(2)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

　　分別吸取土霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1.00ml，金霉素、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液各 2.00m1.置于100ml容量瓶中，用流動相A液定容至刻度，此溶液濃度分別為：土霉素(10μg/m1)、四環(huán)素(10μg/m1)、金霉素(20μg/m1)、氯霉素(20μg/m1)，置于冰箱冷藏室保存。

　　(3)標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

　　準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10.0ml分別置于1Oml容量瓶中，用流動相A液定容至刻度，得到的標(biāo)準(zhǔn)系列為：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10.0μg/m1(土霉素、四環(huán)素);0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/m1(金霉素、氯霉素)。

　　(4)流動相A液的配制

　　0.01mol/L磷酸二氫鈉+0.001mol/L EDTA，用30%硝酸調(diào)至pH=2.0，經(jīng)0.45μm雙層水系濾膜過濾。

　　(5)流動相B液的配制

　　0.01mol/L磷酸二氫鈉，用30%硝酸調(diào)至pH=2.0，經(jīng)0.45μm雙層水系濾膜過濾。

　　(6)樣品前處理

　　準(zhǔn)確稱取5.00g攪碎的水產(chǎn)品于5Oml帶蓋的塑料離心管中，加入20%高氯酸溶液 15ml，渦旋1min，將此離心管放入超聲波清洗器中提取20min后，用離心機(jī)離心10min，收集上清液于25ml容量瓶中，往殘?jiān)屑尤?Oml 2%高氯酸溶液，用玻棒攪動使樣品均勻分散于高氯酸溶液中，將此離心管放入超聲波清洗器中提取20min后，用離心機(jī)離心10min，收集上清液于上述 25ml容量瓶中，合并兩次上清液，用2%高氯酸溶液定容，取該提取液1O ml經(jīng)已調(diào)節(jié)的固相萃取小柱吸附，用10%甲醇水2ml沖洗固相萃取小柱，用50%甲醇水1ml洗脫后收集備用。

　　(7)樣品測定