血清分離實驗?zāi)哪苌俚牧怂?/h3>
離心機被廣泛應(yīng)用于血清分離實驗。
血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，各行使其重要的功能。
血液完全凝固和離心條件是至關(guān)重要的兩個環(huán)節(jié),離心要求采用水平式離心機。具體操作步驟是:采血后立即輕輕倒轉(zhuǎn)采血試管4~5次混勻標(biāo)本,等待標(biāo)本充分凝固需要放置30min,離心半徑200px,離心機離心速度維持在3500~4000r/min離心10min。血清與血凝塊完全被分離膠分離,血清標(biāo)本可直接上機檢測或轉(zhuǎn)移至儀器配套試杯中。具備這個條件才能制備出高品質(zhì)血清標(biāo)本，說明分離膠效果好。
鹽析后蛋白質(zhì)沉淀經(jīng)水溶后，特點是保持蛋白質(zhì)生物學(xué)活性，因此，鹽析法是研究蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和功能的最常用方法。除鹽析法，有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、柱層析法和超速離心法等也是蛋白質(zhì)分離的常用方法。
實驗器材和試劑
1．器材：10ml具塞刻度試管、離心機、離心管、小試管、5ml吸管、滴管2支、培養(yǎng)皿3套、醋酸纖維薄膜、點樣器、電泳槽、電泳儀、1.0×20cm層析柱。
2．試劑：
(1) 葡聚糖凝膠Sephadex G-25：稱10g SephadexG-25，加200ml 0.02mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液溶脹24小時。
(2) 生理鹽水：稱取分析純NaCl 0.89g，蒸餾水稀釋至100ml。
(3) 飽和硫酸銨溶液：25℃時稱取(NH４)２SO4約767g,溶解至1000ml蒸餾水中，至不能完全溶解為止，即為飽和硫酸銨溶液。
(4) 巴比妥緩沖液(pH 8.6)：稱取巴比妥鈉15.458g．巴比妥2.768g，蒸餾水定容至1000m1。
(5) 氨基黑10B染色液：稱取氨基黑10B 0.5g,加入100ml漂洗液不斷振搖,直到完全溶解。
(6) 漂洗液：取95％乙醇450ml，冰醋酸100m1，混勻后，用蒸餾水稀釋到l000ml。
鹽析沉淀蛋白質(zhì)：
取10 m1具塞刻度試管1支，加入血清溶液 2.5ml，緩慢加進等量飽和(NH4)2SO4溶液，充分搖勻，見有沉淀析出，靜置10min，用雙層濾紙過濾，棄去沉淀，取濾液。
蛋白質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因為有兩個穩(wěn)定因素：水化膜和表面電荷。當(dāng)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時，蛋白質(zhì)分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白質(zhì)分子沉淀析出的方法很多，根據(jù)對蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素破壞的不同有中性鹽析法、有機溶溶劑法、重金屬鹽法以及生物堿試劑法等。鹽析法是以中性鹽如硫酸銨((NH４)２SO4)等對蛋白質(zhì)作用破壞蛋白質(zhì)表面水化膜而使蛋白質(zhì)相互聚集而析出。不同的蛋白質(zhì)沉淀需要的中性鹽濃度不同，在不同鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度不同。球蛋白在半飽和狀態(tài)下發(fā)生沉淀，而請蛋白在完全飽和狀態(tài)下沉淀，利用此特性可把蛋白質(zhì)分段沉淀下來，此種鹽析法稱分段鹽析。
此次實驗注意事項：
1、只有經(jīng)過嚴格培訓(xùn)的人員才能進行離心機操作。
2、操作時應(yīng)戴手套以及眼睛和黏膜的保護裝置。
3、規(guī)范的實驗操作技術(shù)可以避免或盡量減少噴濺和氣溶膠的產(chǎn)生。血液和血清應(yīng)當(dāng)小心吸取，而不能傾倒。嚴禁用口吸液。
4、移液管使用后應(yīng)完全浸入適當(dāng)?shù)南疽褐?。移液管?yīng)在消毒液中浸泡適當(dāng)?shù)臅r間，然后再丟棄或滅菌清洗后重復(fù)使用。
5、帶有血凝塊等的廢棄標(biāo)本管，在加蓋后應(yīng)當(dāng)放在適當(dāng)?shù)姆缆┤萜鲀?nèi)高壓滅菌和／或焚燒。
6、應(yīng)備有適當(dāng)?shù)南緞﹣砬逑磭姙R和溢出標(biāo)本。
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